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                    如何利用單光子計數相機輕松搞定FLIM/FRET

                    更新時間:2023-02-21 點擊量:414

                    對于高精度多光子FLIM,時間相關單光子計數(TCSPC)在測量精度方面非常優秀。就成像速度而言,由于發射過程的隨機性,要求檢測率遠小于每個激發事件一個光子,以防止壽命擬合中的不確定性,導致TCSPC在光子計數率方面受到了極大的限制,于是,激光掃描FLIM的采集時間大約需要幾分鐘才能完成,然而在這個時間尺度上,許多動態生物事件已經發生并結束。

                    為了克服該限制,可以采用激光束陣列激發,并配合光電倍增管陣列或時間門控相機檢測系統來進行并行信號采集實現。迄今為止,由于多陽極PMT中的串擾,亦或是由于相機系統中的測量方法導致的系統誤差,大大的限制了并行采集大量通道熒光壽命數據的準確性。當然,對于單光束掃描系統而言,能通過多陽極PMT中的并行檢測來消除計數率限制,從而達到增加幀速率的目的,但與此同時,脈沖堆積效應導致觀察到的熒光壽命中的計數率依賴性誤差比較嚴重。此外,各大應用中常見的在軸向和橫向都具有較低分辨率的體內成像技術,在沒有飽和激發、顯著光毒性和光漂白的情況下,高NA物鏡是不可能實現。因此,以高時間分辨率定量測量復雜生物事件的能力仍然是一個重大挑戰。

                    然而,開發用于顯微鏡和光譜技術的SPAD陣列+TDC 單光子計數相機對于高時間分辨率定量測量復雜生物事件是至關重要的。這里使用的32×32 SPAD陣列相機,其中每個像素包含單獨的定時電路。在新型多焦點、多光子FLIM顯微鏡(MM-FLIM)中,通過并行激發和檢測過程,顯著提高了高分辨率熒光壽命成像的采集速率。該系統的激發部分為二維超快光束陣列(通過SLM全息生成),該光束共軛并精確對準SPAD陣列+TDC 單光子計數相機。將收集的熒光小束直接重新成像到SPAD的光敏感區域上,填充因子光學放大到100%。每個SPAD在TCSPC模式下運行時,顯微鏡系統有效地由64個單獨的多光子FLIM顯微鏡組成,這些顯微鏡并行工作從而實現高數據采集速率。

                    PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計數相機是武漢東隆科技有限公司中國區總代理,它是一款32*32面陣SPAD探測器,區別于一般的SPAD面陣探測器,PF32 SPAD陣列+TDC 單光子計數相機的1024個單光子敏感SPAD像素陣列,都具有超快的55ps 時間分辨率TDC 電子元件,從而形成了一個并行的,功能強大,高度緊湊的系統。這種并行性讓生命科學、量子成像、激光雷達抑或是單光子成像領域的科研工作者,更加方便、簡單的獲取和驗證實驗結果。

                    參考文獻:

                    S. Poland et al., “A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging "

                    Biomedical Optics Express Vol. 6, Issue 2, pp. 277-296 (2015)

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